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噬菌體展示技術(shù)之抗體親和力成熟

更新時(shí)間:2021-08-06點(diǎn)擊次數(shù):1934

近年來(lái),隨著抗體藥物的廣泛上市,抗體已經(jīng)取代基因治療成為生物制藥領(lǐng)域的主要生力軍。而抗體在疾病診斷、治療和預(yù)防方面的作用很大程度上取決于其親和力的高低,隨著抗體工程技術(shù)的不斷發(fā)展,如何提高抗體親和力已成為抗體工程的難題之一。圍繞這一問(wèn)題人們已經(jīng)從不同的角度展開(kāi)了研究,例如,提高抗體庫(kù)的質(zhì)量、增加抗體庫(kù)的多樣性、進(jìn)行抗體重鏈或輕鏈的替換以及點(diǎn)突變有目的進(jìn)行氨基酸替換等都能不同程度地提高抗體親和力。

抗體親和力表示抗體與抗原結(jié)合能力的大小。抗體親和力成熟是指機(jī)體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中,再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答,這種現(xiàn)象稱(chēng)為抗體親和力成熟

噬菌體展示技術(shù)作為一種*的抗體庫(kù)構(gòu)建技術(shù)能結(jié)合多種技術(shù)手段,于體外實(shí)現(xiàn)抗體的親和成熟,并配合親和篩選方法獲得具有高親和力的抗體。在噬菌體抗體展示技術(shù)中,VH和VL基因的隨機(jī)重組,在一定程度上模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程。如果結(jié)合其它技術(shù)則可以使抗體的親和力提高到一個(gè)更高的層次,下面介紹一些抗體親和力成熟的方法。


體外抗體親和力成熟的幾種策略

要想實(shí)現(xiàn)抗體的親和力體外成熟,就必須充分地了解天然抗體的親和力體內(nèi)成熟原理,設(shè)計(jì)模擬體內(nèi)可能出現(xiàn)和存在的變化,從而促進(jìn)抗體的體外進(jìn)化。

天然抗體的親和力成熟可以分為體細(xì)胞高頻突變克隆選擇兩個(gè)過(guò)程。在天然抗體親和力成熟的過(guò)程中,抗原刺激下的體細(xì)胞高頻突變有著舉足輕重的作用,因此親和力體外成熟的策略也多在抗體基因突變水平上,即采用各種突變方法來(lái)模擬體內(nèi)的高頻突變。

1. 隨機(jī)突變

(1)錯(cuò)配PCR

通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件,提高核酸錯(cuò)配率將隨機(jī)突變引入基因序列。該技術(shù)可以通過(guò)提高鎂離子濃度、加入錳離子、失衡4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)濃度、使用低保真DNA聚合酶等方法,來(lái)提高抗體基因的突變率。

除此之外,突變率的高低也可以采用改變模板DNA 的復(fù)制次數(shù)進(jìn)行控制。復(fù)制次數(shù)越多,突變率將累積得越高。理論上經(jīng)過(guò)多輪的PCR反應(yīng)可獲得0.15%~3%的突變頻率,再用突變的抗體基因庫(kù)建立噬菌體抗體庫(kù),最后從中篩選高親和力抗體。噬菌體展示技術(shù)有效的改善了使用錯(cuò)配PCR技術(shù)導(dǎo)致的抗體親和性和特異性的喪失,以及有效突變體過(guò)少的問(wèn)題。

(2)DNA改組

DNA改組技術(shù)是對(duì)同源的抗體基因,采用脫氧核糖核酸酶Ⅰ將其切割成不超過(guò)50 bp的片段,再隨機(jī)組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增成完整的抗體基因。它包含了抗體片段隨機(jī)化切割、重組和篩選的過(guò)程,一定程度上模擬了天然抗體的親和力成熟過(guò)程,并加快了體外定向進(jìn)化速度。采用連續(xù)多輪的DNA改組具有去除有害突變優(yōu)勢(shì)。另外,DNA 改組獲得的突變體,突變位點(diǎn)可以位于非抗原直接接觸的區(qū)域,有擴(kuò)大庫(kù)容的作用。

(3)鏈改組

鏈改組即鏈替換技術(shù),是固定抗體的一條輕鏈或重鏈不變,而將另一條重鏈或輕鏈經(jīng)過(guò)突變處理后,重新與固定鏈配對(duì),以提高抗體親和力的方法。 該方法保留一條鏈不變,目的是為了保持抗體的特異性,而將經(jīng)過(guò)突變處理的另一條鏈與其配對(duì),是為了增加抗體的親和力,以篩選到更高親和力的抗體,重復(fù)進(jìn)行鏈替換和親和力篩選將產(chǎn)生更高親和力的抗體。

將噬菌體展示技術(shù)與此技術(shù)結(jié)合構(gòu)建次級(jí)抗體庫(kù)將使該法更便利。鏈改組技術(shù)能有效提高抗體親和力,但如果無(wú)法明確了解zhiding抗原的基因結(jié)構(gòu),或者抗體基因片段未能擁有一個(gè)比較完整的初級(jí)抗體庫(kù),則不適合使用鏈改組技術(shù)。

(4)突變株

Escherichia coli MutD5 是常用的大腸埃希菌突變株,該菌株可以校對(duì)和復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)缺陷,產(chǎn)生高頻率的單個(gè)堿基替換,突變率高于普通菌株105倍。突變株法的優(yōu)勢(shì)是突變發(fā)生在轉(zhuǎn)化宿主菌后,而其他方法的突變均發(fā)生于轉(zhuǎn)化之前,而轉(zhuǎn)化效率是限制大容量突變庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵因素之一。使用突變株法可以構(gòu)建庫(kù)容為1012 - 1014個(gè)克隆的超大容量抗體庫(kù),利用噬菌體展示技術(shù)篩選高親和抗體,通過(guò)該法的可以獲得一些未能在定向突變中獲得的突變體。但是該方法較難對(duì)突變率進(jìn)行控制,且獲得的隨機(jī)突變也可能發(fā)生于載體部分,造成有害突變。

2. 定向引入突變

CDR重組

由于天然抗體在親和力成熟過(guò)程中,體細(xì)胞高頻突變發(fā)生區(qū)域并非均勻分布,而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR(complementarity-determining region,CDR)區(qū)。這樣既可以獲得足夠的序列多樣性,又不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此在抗體的親和力體外成熟中,CDR 區(qū)是最常選用的定點(diǎn)突變區(qū)域。

CDR重組技術(shù)即將多種突變或經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的DNA序列引入抗體多個(gè)CDR區(qū),再利用抗體庫(kù)技術(shù)將這些CDR區(qū)進(jìn)行多次重組,已達(dá)到親和成熟的目的。該技術(shù)使噬菌體展示技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用,并且相對(duì)于熱點(diǎn)突變其能更完整的模擬體內(nèi)抗體輕鏈與重鏈重排的整個(gè)過(guò)程,該方法可結(jié)合多種技術(shù)使用。

除了CDR區(qū)突變外,天然抗體親和力成熟中的突變熱點(diǎn)也是常見(jiàn)的定點(diǎn)突變位點(diǎn)。這些熱點(diǎn)通常包含或接近AGY和RGYW(R = A or G;Y = C or T;W = A or T)序列。

基因工程抗體親和力成熟的過(guò)程其實(shí)就是一個(gè)體外的分子進(jìn)化,多樣化的選擇和擴(kuò)增的過(guò)程。根據(jù)對(duì)抗體親和力成熟的認(rèn)知,各種模擬體細(xì)胞高頻突變有效引入突變的策略是親和力成熟的核心,而基于不同原理的突變策略的組合應(yīng)用可能對(duì)基因工程抗體的親和力成熟有協(xié)同增強(qiáng)的作用。研究基因工程抗體的親和力成熟,制備得到高親和力的抗體,可以幫助我們?cè)谂R床上使用低劑量達(dá)到我們需要的生物學(xué)效應(yīng),減少劑量導(dǎo)致的毒性反應(yīng),增加治療效果,在抗體藥物研發(fā)進(jìn)程中至關(guān)重要。


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