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當前位置:首頁產品中心抗體工程人源化單抗制備抗體人源化

抗體人源化

產品簡介

抗體人源化改造是增加異源抗體中人源序列比率的過程。隨著雜交瘤技術的發展,大批的與抗原有特異親和力的異源(通常是鼠源)抗體引起了人們的興趣,但是由于HAMA效應的存在,大大限制了這些抗體在臨床上的應用。

產品型號:
更新時間:2020-05-12
廠商性質:代理商
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抗體人源化簡介

抗體人源化改造是增加異源抗體中人源序列比率的過程。隨著雜交瘤技術的發展,大批的與抗原有特異親和力的異源(通常是鼠源)抗體引起了人們的興趣,但是由于HAMA效應的存在,大大限制了這些抗體在臨床上的應用。而且這些異源抗體往往半衰期短,且能引起機體的炎癥效應。抗體人源化的過程就是解決異源單克隆抗體免疫原性,改善抗體對人體免疫系統的活化作用。

艾柏森生物擁有豐富的抗體人源化經驗,我們利用多種策略進行抗體的人源化改造,可以在保留抗體特異性的同時,大部分或者全部消除異源抗體在人體內的免疫原性。其中包括重構抗體、鏈替換抗體及表面重塑抗體等,通過建立噬菌體展示的人源化突變庫,篩選出高親和力的人源化抗體,也可以通過哺乳動物細胞表面展示技術建立人源化的IgG庫,通過FACS分類篩選。

艾柏森生物人源化服務基本流程:

抗體測序——同源建模——CDR移植——設計改造

服務流程:

抗體人源化.1.png

技術流程:

艾柏森生物提供多樣化的策略,包括:

抗體人源化策略:CDR&SDR移植、鏈替換及人源IgG抗體庫篩選;

抗體親和力成熟策略包括:隨機突變、定點突變等多種突變方式;

結合專有人類抗體數據庫、電子建模等技術。

CDR移植抗體構建流程:

1.質控

對客戶提供的親本抗體做活性驗證,確認是否有必要進行人源化改造。

2.抗體基因獲得

提取雜交瘤細胞中mRNA,反轉錄為cDNA,PCR擴增VH和VL鏈,測序。

3.生物信息學方法設計人源化方案

3.1分析親本抗體VH和VL序列,進行亞型分類、計算機模擬抗體結構分析及多序列比對進行CDR區和FR區定位,確定FR區保守氨基酸及關鍵氨基酸殘基及其位置。

a. V區、CDR及FR序列的確定

抗體人源化.2.png

利用序列相似性搜索方法確定恒定區(CH和Cκ),然后找到序列引物,之間即為V區。將V區基因序列翻譯為氨基酸序列,通過Kabat數據庫和Swiss-Port數據庫比較,確定CDR和二硫鍵位置。

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表: h-TNFα鼠單抗CDR和FR確定;*代表二硫鍵的Cys位置

b.抗體V區結構同源建模及抗原抗體復合物模型構建

(1)模板蛋白的選擇

利用PDB數據庫,搜索抗體V區同源蛋白,從而確定模板蛋白結構和序列,如下圖。

抗體人源化.4.png

(2)SCR和Loop區的確定

利用Structure Superimpose法對模板蛋白進行結構相似性分析,確定模板蛋白的結構保守區(SCR)和無規則環區(Loop)。通過多序列比對,確定目的蛋白的SCR和Loop。

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(3)抗體VH和VL初始結構的獲得

抗體人源化.6.png

(4)初始結構構象優化及分子動力學模擬

首先用Insight Ⅱ(2000)中Rotamer軟件對模型構象的二面角調整,再用Discovery軟件,在CVFF、Gromos力場下,經陡下降、共軛梯度、牛頓力學等步驟對抗體V區構象進行優化。再通過動力學優化,獲得穩定的空間構象。見圖1。

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圖:經過分子模擬、力學優化、動力學模擬獲得抗體VH和VL碳原子空間構象

(5)抗體V區空間構象合理性判斷

利用Ramachandran圖對獲得的抗體可變區構象進行評價,如下圖所示,不同顏色代表了氨基酸殘基構象的合理程度。紅色代表殘基構象匹配適宜,深黃色表示殘基構象允許區,土黃色表示構象可以,白色表示構象存在較大誤差。

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圖 利用Ramachandran圖對抗體的V區殘基進行構象評估

(5)抗體可變區Fv構象的獲得

選擇同一個包含VH和VL的構象的模板為參考,考慮VH和VL相互作用模式,分析可及性表面是和表觀靜電分布情況,利用Molecular Docking的方法獲得抗體V區構象。

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圖3 抗體可變區的空間構象

抗體人源化.10.png

(6)抗原-抗體復合物模型的建立

抗原-抗體相互作用復合物結構是合理判定抗原表位、抗體合理改造與設計的基礎。利用Molecular Docking方法,探討抗原-抗體相互作用,確認二者相互識別過程中靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華力作用等,預測二者的結合模式和親和能力,從而進行抗原表位合理預測、抗體人源化和親和力改造。

抗體人源化.11.png

圖   利用分子對接方法建立抗原-抗體復合物結構模型

(7)抗體FR區中重要氨基酸殘基的確定

利用SAS方程,計算可及性表面積;利用Delphi程序,計算表觀靜電分布。基于以下原則確定抗體FR區中重要氨基酸殘基:

抗體人源化.12.png

3.2通過Kabat、Genebank和IMGT等數據庫檢索比對和輔助計算機分子模擬,尋找大同源性的人FR區模板,設計CDR移植scFV,進行計算機結構模擬分析。

a. 人源抗體模板的選擇及FR區保守氨基酸的確定

在NCBI網站,運行IgBLAST,通過BlastP程序,檢索人源庫中鼠抗體V區同源序列,通過序列比對歸納出人抗體FR中高頻率出現的氨基酸殘基及位置。

抗體人源化.13.png

b. 鼠源抗體人源化過程中需要改變的殘基確定

根據可及表面積、表觀靜電分布及序列比對的結果,確定人源化過程中需要改變的氨基酸殘基。

抗體人源化.14.png

c. 點突變的Fv空間結構模擬

利用計算機建模、力學優化及動力學模擬得到人源化抗體的V區構象,通過結構疊合進行親本抗體和人源化抗體的構象比較。

d. 人源化后抗體活性預測

借助Molecular Docking和動力學模擬優化人源化后抗體-抗原復合物的結構,通過相互作用能、分子間氫鍵以及識別表位,從理論上評價異源抗體人源化后的生物學活性。

3.3表達重構抗體和親本scFV抗體

根據計算機模擬設計的人源化方案,合成基因,表達48-126個重構抗體,分別測定其與抗原的相對結合活性。測定親本scFV抗體親和力,挑選親和力的人源化抗體克隆,進行親和力成熟改造。

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